Blog

Zugehörige Daten

Abstrakt

Hintergrund

(±)-Modafinil hat das Interesse zur Behandlung von ADHS und Stimulanzienabhängigkeit geweckt. Das R-Enantiomer von Modafinil kann einzigartige pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die weiter untersucht werden sollten.

Methoden

(±)-Modafinil und seine R-(−)- und S-(+)-Enantiomere wurden synthetisiert und auf Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme und [ 3 H]WIN 35,428-Bindung in hDAT WT und Mutanten mit veränderter Konformation getestet Gleichgewichte. Die Daten wurden mit Kokain und dem atypischen Dopamin-Aufnahmehemmer JHW 007 . verglichen. R- und S-Modafinil wurden auch in Mikrodialysestudien in der Maus-NAC-Schale und in einem Kokain-Diskriminierungsverfahren bewertet evaluated.

Ergebnisse

(±)-, R- und S-Modafinil binden an das DAT und hemmen die Dopaminaufnahme weniger stark als Kokain, wobei R-Modafinil

3-fach höhere Affinität als sein S-Enantiomer. Molekulare Docking-Studien zeigten subtile Unterschiede in den Bindungsmodi der Enantiomere. R-Modafinil war in der DAT-Y156F-Mutante im Vergleich zu Wildtyp-DAT signifikant weniger wirksam, während S-Modafinil weniger betroffen war. Studien mit der Y335A DAT-Mutante zeigten, dass die R- und S-Enantiomere die nach innen gerichtete Konformation besser tolerierten als Kokain, was durch die MTSET-Reaktivität auf dem DAT E2C I159C . weiter unterstützt wurde. Mikrodialysestudien zeigten, dass sowohl R- als auch S-Modafinil einen Anstieg der extrazellulären DA-Konzentrationen in der NAc-Hülle weniger wirksam als Kokain und mit längerer Wirkungsdauer bewirkten. Bei Mäusen, die darauf trainiert waren, Kokain von Kochsalzlösung zu unterscheiden, wurden beide Enantiomere vollständig substituiert.

Schlussfolgerungen

R-Modafinil zeigt ein anderes In-vitro-Profil als Kokain. Zukünftige Studien mit R-Modafinil als Ersatztherapie mit dem potenziellen Nutzen einer kognitiven Verbesserung bei Psychostimulanziensucht sind gerechtfertigt.

Die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Stimulanzienmissbrauchsstörungen bleibt trotz jahrzehntelanger Forschung ein ungedeckter medizinischer Bedarf (1–3). Ein Ansatz zur Bewältigung dieser Herausforderung besteht darin, die „Rückübersetzung“ klinisch verfügbarer Medikamente zu verwenden, deren Wirkmechanismen mit denen von Suchtmitteln verwandt sein können, wie z. B. die Hemmung der Dopamin (DA)-Wiederaufnahme über den Dopamin-Transporter (DAT). Durch die weitere Untersuchung dieser Wirkstoffe auf molekularer Ebene und die Verknüpfung dieser Beobachtungen mit dem Verhalten kann eine Begründung für die Prüfung dieser Wirkstoffe bei Menschen, die von Psychostimulanzien abhängig sind, bereitgestellt werden. Hier vergleichen wir Kokain mit dem klinisch verfügbaren (±) Modafinil, seinem R-Enantiomer (Armodafinil) und S-Modafinil am DAT.

Modafinil (Abb. 1 ) wird als wachförderndes Mittel zur Behandlung von Narkolepsie und anderen Schlafstörungen eingesetzt (4). Modafinil wurde als Psychostimulans beschrieben, ist jedoch in seiner chemischen Struktur, seinem pharmakologischen Profil oder seinem Wirkmechanismus nicht amphetaminähnlich. Als solches hat es das Interesse an der Behandlung kognitiver Dysfunktionen bei Störungen wie der Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS) geweckt (4, 5). Modafinil hat auch Aufmerksamkeit für die Behandlung von Kokain (6) und Methamphetaminabhängigkeit (7, 8) auf sich gezogen. Darüber hinaus hat die zunehmende Betonung kognitiver Beeinträchtigungen bei neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Sucht (9), Untersuchungen zu den potenziellen prokognitiven Wirkungen von Modafinil in dieser Population angeregt (10-12).

Die Wirkmechanismen, die den therapeutischen Wirkungen von Modafinil zugrunde liegen, wurden diskutiert. Modafinil moduliert die Aktivität von Hypocretin-, Histamin-, α-adrenergen, γ-Aminobuttersäure (GABA) und/oder Glutamatrezeptoren (4, 13). Seine Fähigkeit, an DAT zu binden und die DA-Wiederaufnahme zu blockieren, hat jedoch die meiste Aufmerksamkeit erregt, wenn auch mit geringer Affinität im Vergleich zu Kokain (14–17). Studien mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) an menschlichen Probanden haben gezeigt, dass Modafinil in therapeutischen Dosen an das DAT bindet, was zu Warnungen bezüglich seines Missbrauchspotenzials führt (18). Obwohl präklinische Daten darauf hindeuten, dass Modafinil wie Kokain ist oder den Kokainkonsum wieder aufnehmen kann (19–23), weist die überwiegende klinische Literatur auf eine geringe Missbrauchsgefahr hin (24–26).

Modafinil besteht aus R-(−)- und S-(+)-Enantiomeren ( Abb. 1 ) und wurde ursprünglich als Racemat (Provigil) verschrieben (27). Neuere Humanstudien legen jedoch nahe, dass R-(−)-Modafinil ist das stoffwechselstabilere und länger wirkende Enantiomer (28–31). Wir haben kürzlich die R- und S-Modafinil-Enantiomere sowie eine Reihe von Analoga hergestellt und gezeigt, dass das R-Enantiomer

3-fach höhere Affinität für das DAT als das S-Enantiomer in Rattenhirngewebe (17). Obwohl die (±)-, R- und S-Enantiomere alle die lokomotorische Aktivität bei Mäusen stimulierten, waren sie weniger wirksam und weniger wirksam als Kokain. Die reduzierte Wirksamkeit und die ungewöhnliche Struktur von Modafinil deuteten darauf hin, dass es anders als Kokain an das DAT binden könnte. Tatsächlich ähnelt das Biphenyl-Ringsystem dem der Benztropinklasse der DAT-Inhibitoren, am Beispiel von JHW 007 (Abb. 1 ), das weitgehend als „atypisch“ mit Entwicklungspotenzial als Medikament zur Behandlung der Kokainsucht charakterisiert wurde (32, 33).

Wir haben zuvor die Bindungs- und DA-Aufnahme-Hemmung einer Reihe von Tropan-basierten DAT-Inhibitoren in mehreren DAT-Mutanten verglichen, die das Konformationsgleichgewicht entweder in einen nach außen oder nach innen gerichteten Zustand verschieben sollten (34, 35). In dieser Studie entdeckten wir, dass die kokainähnlichen Verbindungen (e.G. WIN 35,428) bevorzugten eine nach außen gerichtete Konformation des DAT, während die Benztropine (e.G. JHW 007) bevorzugte ein geschlosseneres Exterieur. Bemerkenswerterweise korrelierten diese Daten mit der Wirksamkeit bei der Erzeugung kokainähnlicher Wirkungen bei Ratten (36). In nachfolgenden Studien wurden diese Unterschiede in den Bindungsmodi unterstützt und unterschiedliche DAT-Bindungswechselwirkungen zwischen diesen strukturell unterschiedlichen Klassen von DAT-Inhibitoren weiter hervorgehoben (37, 38).

Basierend auf diesen Studien stellten wir die Hypothese auf, dass R- und S-Modafinil das DAT auch anders als Kokain binden könnten, was zu ihren pharmakologischen In-vivo-Profilen beiträgt. Daher vergleichen wir in der vorliegenden Studie die Bindung der Enantiomere und ihre Wirksamkeit zur Hemmung der DA-Aufnahme in hDAT-transfizierten COS-7-Zellen mit denen von Kokain. Anschließend testeten wir die Enantiomere in DAT-Mutanten, die auf nach innen oder außen gerichtete Konformationen ausgerichtet waren, um die Induktion spezifischer Konformationen der DAT durch Modafinil-Bindung zu untersuchen. Darüber hinaus wurden die DA-Konzentrationen in der NAc-Schale der Maus in vivo mit Mikrodialyseverfahren bestimmt. Es wird vermutet, dass dieser Gehirnbereich eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der verstärkenden Wirkung von missbrauchten Drogen spielt (39–41). Schließlich testeten wir Modafinil und seine Enantiomere in einem Kokain-Diskriminierungsverfahren, um zu bestimmen, ob die Enantiomere die diskriminierenden Stimulus-Effekte von Kokain ersetzen, wie dies von (±)-Modafinil bei anderen Spezies berichtet wurde (19, 22, 23).

Methoden

In-vitro-Studien

[ 3 H]DA-Aufnahme und [ 3 H]WIN 35,428-Bindungsexperimente wurden unter Verwendung von Standardmethoden an transient transfizierten COS-7-Zellen durchgeführt, die das humane DAT WT oder Mutanten exprimieren, wie zuvor beschrieben (35) und ausführlich in S.ich. Die Markierungsexperimente mit [2-(Trimethylammonium)ethyl]-methanthiosulfonat (MTSET) wurden im Wesentlichen wie zuvor (36) durchgeführt und ausführlich in S . beschrieben.ich. Kurz gesagt wurden die in Aufnahmepuffer (UB) gelösten Liganden zu den intakten Zellen gegeben, die entweder DAT E2C oder DAT E2C I159C in den folgenden Konzentrationen exprimierten: (±)-Modafinil: 100 µM, R-(−)-Modafinil: 100 µM , S-(+)-Modafinil: 100 μM, DA: 100 μM, Kokain: 30 μM und JHW 007: 5 μM. Die Konzentration des Inhibitors wurde als die höchstmögliche Konzentration gewählt, die ausgewaschen werden konnte, um eine anschließende [ 3 H]DA-Analyse zu ermöglichen. MTSET wurde in einer Endkonzentration von 0 . zugegeben.5 mM und die Zellen wurden 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Präinkubation wurde gestoppt und die [ 3 H]DA-Aufnahme initiiert, um den Grad der Transportinaktivierung durch MTSET . zu bestimmen.

Modellierung von DAT/Ligand-Komplexen

Die Komplexe zwischen DAT und Modafinil-Enantiomeren wurden ähnlich wie zuvor beschrieben (38) unter Verwendung eines gut etablierten induzierten-Fit-Docking-(IFD)-Protokolls (42) modelliert und sind im Detail in S . beschrieben.ich.

Mikrodialyse

Methoden wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben (43) und in S . bereitgestellt.ich. Kurz nach ca. 45 Stunden nach den chirurgischen Eingriffen und ab 9.00 Uhr.ich. Mikrodialysesitzungen wurden mit Sonden eingeleitet, die über Drehgelenke verbunden und mit Ringer-Lösung mit einer konstanten Flussrate von 1 μl/min durchströmt wurden. Dialysatprobenahme (10 μl/10 min) nach ca. 30 Minuten gestartet. Mäuse erhielten Kokain-, (±)-, S- oder R-Modafinil- oder Vehikelinjektionen nur, wenn stabile DA-Werte erreicht wurden. Die Probenentnahme wurde 360 ​​min fortgesetzt, erfolgte jedoch nach 2 Stunden alle 20 min. Dialysatproben wurden sofort ohne Reinigung in eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit einem ESA 5200 Coulochem-Detektor injiziert, um DA . zu quantifizieren. Die Assay-Sensitivität für DA betrug 2 fmol pro Probe.

Diskriminierung von Kokain

Die experimentellen Details sind im Wesentlichen identisch mit den zuvor beschriebenen (44) und in S . bereitgestellt.ich.. Kurz gesagt, die Probanden wurden in operierende Konditionierungskammern mit Gesamtbeleuchtung, zwei Reaktionshebeln und Paaren grüner und gelber Lichter über jedem Hebel untergebracht placed. Mäuse wurden mit Nahrungsverstärkung trainiert, um beide Hebel zu drücken, und schließlich darauf trainiert, einen nach Kokain (10 mg/kg) und den anderen nach Kochsalzlösung zu drücken.p. Injektionen im doppelten Wechsel-Tagesplan. Das Verhältnis der Antworten auf Futterpellets betrug letztendlich 10 (fixes Verhältnis oder FR 10). Experimentelle Sitzungen begannen nach einer 5-minütigen Dunkelheit, in der die Reaktionen keine Konsequenzen hatten. Danach wurden die Lichter eingeschaltet, bis die FR-Anforderungen und die Präsentation der Lebensmittel erfüllt waren. Die Sitzungen endeten nach 20 Essenspräsentationen oder 15 Minuten, je nachdem, was zuerst eintrat, und wurden an 5 Tagen pro Woche durchgeführt. Der Test mit verschiedenen Kokain- oder Modafinil-Dosen wurde eingeleitet, nachdem die Probanden die Trainingskriterien erfüllt hatten (siehe S.ich.). Testsitzungen waren identisch mit Trainingssitzungen, mit der Ausnahme, dass 10 Antworten auf beiden Hebeln verstärkt wurden.

Ergebnisse

Bewertung der Affinität von (±)-Modafinil und seinen R- und S-Enantiomeren zum DAT

(±)-Modafinil und seine Enantiomere wurden auf Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme und Verdrängung von [ 3 H]WIN 35,428 getestet (Abb. 2). (±)-Modafinil hemmte die [ 3 H]DA-Aufnahme mit einer Wirksamkeit, die mehr als 7-mal niedriger war als für DA beobachtet (Hemmwirkung für DA und (±)-Modafinil für DAT betrug 1.7 bzw. 13 μM, Abb. 2A und Tabelle 1). Die Hemmung der [ 3 H]WIN 35.428-Bindung durch (±)-Modafinil zeigte niedrigere K_ich Werte im Vergleich zur Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme (K_ich = 2.3 μM, Abb. 2B und Tabelle 1) und vergleichbar mit unseren zuvor veröffentlichten Werten in Rattenhirngewebe (17). Interessanterweise hemmte (±)-Modafinil die [ 3 H]DA-Aufnahme weniger stark als sowohl die R- als auch die S-Enantiomere ( Abb. 2C und Tabelle 1). Bei der Hemmung der [ 3 H]WIN 35,428-Bindung war die beobachtete Affinität für das S-Enantiomer jedoch fast nicht von der Affinität für das Racemat zu unterscheiden, während das R-Enantiomer eine höhere Affinität aufwies (Tabelle 1). Die Diskrepanz zwischen Hemmpotenzen von DA-Transport und K_ich Werte im Bindungsassay könnten darauf zurückzuführen sein, dass die Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme nicht unter Gleichgewichtsbedingungen durchgeführt wird, da die Bindungsexperimente.

Hemmung der (A+C) [ 3 H]DA-Aufnahme und (B+D) [ 3 H]WIN 35.428-Bindung in COS-7-Zellen, die vorübergehend DAT WT exprimieren durch (●)DA, (▲) WIN 35.428, (■) (±)-Modafinil, (○) S-Modafinil und (□) R-Modafinil. Die grauen gestrichelten Linien in (C) und (D) sind die beobachteten IC₅₀ Werte für (±)-Modafinil aus (A) bzw. (B) zum Vergleich gezeigt. Der beobachtete IC₅₀ Wert für eine Verbindung ist Grundlage für die berechneten Hemmpotenzen und K_ich Werte in Tabelle 1 . Daten sind Mittelwerte ± S.E. von 6 bis 10 Experimenten in dreifacher Ausführung.

Tabelle 1

[ 3 H]DA-Aufnahmehemmung und [ 3 H]WIN 35.428 Bindungsdaten in DAT WT und Mutanten

hDAT-Mutanten	[ 3 H]DA-Aufnahme (N)	IC50 (μM) [SE-Intervall]	[ 3 H]WIN 35.428 Bindung (N)	Kd (oder Kich; μM) [SE-Intervall]
hDAT	DA	N=6	1.7[1.5;2.1]
Kokain	N=12	0.23 [0.19;0.26] a	N=3	0.45 [0.34;0.59] b
WIN 35.428	N=10	0.013[0.012;0.014]
(±)-Modafinil	N=6	13[10;16]	N=7	2.3[1.9;2.6]
R-Modafinil	N=9	4.0[2.6;6.4]	N=7	0.78[0.67;0.90]
S-Modafinil	N=9	8.7[7.5;10]	N=8	2.5 [2.2;2.9]
hDAT Y156F	Kokain	N=5	0.35 [0.28;0.45] b
WIN 35.428	N=6	0.013[0.0096;0.017]
(±)-Modafinil	N=5	8.0[6.4,9.9]
R-Modafinil	N=3	11[7.5;15]
S-Modafinil	N=5	5.5[4.7;6.4]
hDAT Y335A	DA	N=3	0.99[0.60;1.7]
Kokain	N=12	24[20;30] a
(±)-Modafinil	N=4	83[48;143]
R-Modafinil	N=3	43[26;71]
S-Modafinil	N=3	129[97;170]

Die Hemmwirkung für die [ 3 H]Dopamin-Aufnahme und die K_d oder K_ich für die [ 3 H]WIN 35.428-Bindung wurden aus einer nichtlinearen Regressionsanalyse der Aufnahme- bzw. Bindungsdaten berechnet, die an COS7-Zellen durchgeführt wurden, die vorübergehend mit hDAT WT oder der angegebenen Mutante transfiziert wurden. Der IC₅₀ Werte, die bei der Schätzung von K . verwendet werden_ich und K_d Werte wurden aus dem Mittelwert von pIC . berechnet₅₀ Werte und das SE-Intervall aus dem pIC₅₀ ±SE (Siehe Materialien und Methoden, S.ich.). nd, nicht bestimmt.

Wir konnten keine signifikante Bindungs- oder Transporthemmung der R- und S-Enantiomere an einen der homologen Transporter für Noradrenalin (NET) oder Serotonin (SERT) messen, bewertet anhand ihrer Fähigkeit, die [ 3 H]DA-Aufnahme zu hemmen oder [ 3 H]nisoxetin-Bindung am NET und [ 3 H]5-HT am SERT (IC₅₀ > 100 μM für alle Experimente, N=3, Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen stimmen auch mit Bindungsexperimenten überein, die in nativem Rattenhirngewebe durchgeführt wurden (17).

Die Modafinil-Bindungsstelle in DAT überlappt mit der zentralen Bindungsstelle für Substrat (S1)

Um die Modafinil-Bindungsstelle in der DAT zu charakterisieren, führten wir eine Docking-Studie der beiden Enantiomere mit zuvor beschriebenen DAT-Modellen (37, 38) basierend auf der Kristallstruktur des bakteriellen Homologs LeuT durch ( Abb. 3A und B). Die Modafinil-Enantiomere wurden in der primären Bindungstasche (S1) im Zentrum des Proteins angedockt, die auch die Bindungsstelle für DA und Kokain (37) sowie für den atypischen DAT-Inhibitor JHW 007 und seine Analoga (38) ist. Die Bindungsposen an der Spitze zeigten eine signifikante Ähnlichkeit zwischen den Bindungsmodi der Enantiomere, jedoch mit einzigartigen Wechselwirkungen. Ein charakteristisches strukturelles Merkmal von Modafinil im Vergleich zu Kokain oder JHW 007 besteht darin, dass ihm ein geladener pyramidaler Stickstoff fehlt. Während die Orientierungen der Biphenylringsysteme in den Bindungsmodi beider Modafinil-Enantiomere denen der Benztropinderivate (38) ähnlich sein können, gibt es keine direkte Wechselwirkung mit Asp79. Im Gegensatz dazu neigt die terminale Amideinheit von Modafinil dazu, mit dem Phenylring von Phe76 und einer H-Brücke zum Rückgrat von Ser321 . zu stapeln. Diese Beschränkungen führen zu einer unterschiedlichen Positionierung des chiralen S=O in den R- und S-Enantiomeren. Obwohl sich beide Enantiomere in unmittelbarer Nähe zu Tyr156 befinden, interagiert das S=O von R-Modafinil mit der -OH-Gruppe des Tyr156-Restes, während diese Wechselwirkung bei S-Modafinil nicht auftritt.

(A) und (B) Die vorhergesagten Bindungsmodi von R-Modafinil bzw. S-Modafinil an der zentralen Bindungsstelle von DAT. Beachten Sie, dass die Amidbindung beider Modafinile mit dem Phenylring von Phe76 und der Carboxylgruppe von Asp79 gestapelt ist, während nur die Sulfinylgruppe von R-Modafinil mit der Hydroxylgruppe von Tyr156 interagiert. Die Modafinil-Enantiomere sind in einer dickeren Stiftpräsentation mit dem Kohlenstoff in Cyan . gefärbt. (C) Entfernung der Hydroxylgruppe von Tyr156 in DAT (Y156F. offene Symbole) ergibt a >14-fache Abnahme des IC₅₀ für R-Modafinil im Vergleich zum DAT WT (durchgezogene Symbole). (D) Bei S-Modafinil verursachte die Y156F-Mutation eine 2-fache Abnahme der IC₅₀-Wert. Alle Daten in C+D werden durch Verdrängung der [ 3 H]WIN 35,428-Bindung durch das angegebene Modafinil-Enantiomer bewertet, durchgeführt an intakten COS-7-Zellen, die vorübergehend mit DAT WT oder mutant mut transfiziert wurden. Daten sind Mittelwerte ± S.E. von 3 bis 8 Experimenten in dreifacher Ausführung.

Daher versuchten wir, die Docking-Ergebnisse experimentell zu validieren und stellten die Hypothese auf, dass die Entfernung der OH-Gruppe von Tyr156 durch deren Umwandlung in ein Phenylalanin (Y156F) die Wechselwirkung mit R-Modafinil stören könnte, aber nur einen geringen Einfluss auf die S-Modafinil-Bindung hat Interaktion. Tatsächlich zeigte R-Modafinil eine deutliche Abnahme der Affinität für die DAT-Y156F-Mutante im Vergleich zum DAT-WT-Protein (Abb. 3C) mit einer 14-fachen Änderung (Tabelle 1, vergleiche WT- und Y156F-DAT-Bindung), während für S-Modafinil durch die Y156F-Mutation nur ein 2-facher Unterschied in der Affinität beobachtet wurde (Abb. 3D, Tabelle 1). Diese Daten stimmen mit den Docking-Modellen überein und legen nahe, dass nur R-Modafinil mit Tyr156 in der primären Bindungstasche interagiert.

R- und S-Modafinil binden bevorzugt an eine andere DAT-Konformation als Kokain

Um den bevorzugten DAT-Konformationszustand zu identifizieren, der durch R- und S-Modafinil induziert wird, wurden zwei zuvor etablierte Methoden (36) verwendet, die den Konformationszustand der DAT nach Bindung verschiedener Liganden bestimmen: (i) Die Verschiebung von IC₅₀ für die Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme durch die Modafinil-Enantiomere zwischen dem WT und einer Tyr335-zu-Alanin-Mutation und (ii) der Zugänglichkeit eines in TM3 eingefügten Cysteins für die Cystein-reaktive Verbindung [2-(Trimethylammonium)ethyl]-methanthiosulfonat (MTSET). Wir haben bereits gezeigt, dass Tyr335 entscheidend für die Regulierung der Konformationsisomerisierung im Transportzyklus ist (34, 35, 45) und dass die Mutation dieses Rests (Y335A) das Konformationsgleichgewicht in Richtung einer nach innen gerichteten Konformation verschiebt. Dieser Vorschlag wurde kürzlich durch die Kristallisation der nach innen gerichteten Konformation von LeuT unter Verwendung der verwandten Mutation unterstützt (46). Somit kann die Y335A-Mutation als Werkzeug verwendet werden, um zu untersuchen, ob ein Medikament eine nach innen oder nach außen gerichtete Konformation bevorzugt (36). Um dies für die Modafinil-Enantiomere zu beurteilen, untersuchten wir ihre [ 3 H]DA-Aufnahme-Hemmwirkung in der DAT Y335A-Mutante und verglichen sie mit WT ( Abb. 4A). Wie zuvor festgestellt, binden DAT-Inhibitoren wie Kokain bevorzugt an die nach außen gerichtete Konformation des DAT. Dies führt zu einer starken Abnahme der Wirksamkeit für die Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme zwischen DAT WT und der Y335A-Mutante, wie in Abb. 4A für Kokain, was zu einer fast 200-fachen Änderung des IC . führt₅₀. Im Gegensatz dazu zeigt der nicht stimulierende atypische DAT-Inhibitor JHW 007 nur eine geringfügige,

20-fach, IC-Änderung₅₀, was darauf hindeutet, dass es an eine Konformation bindet, die sich von der von Kokain bevorzugten (Abb. 4A). Die Durchführung der gleichen Experimente an den R- und S-Modafinil-Enantiomeren ergab Y335A:WT IC₅₀ Verhältnisse (10.6 und 14.8, bzw.), die sich denen für JHW 007 annähern ( Abb. 4A). Dies legt nahe, dass diese DA-Aufnahme-Inhibitoren an eine DAT-Konformation binden, die sich von der durch Kokain induzierten Konformation unterscheidet und näher an der für JHW 007 beobachteten liegt.

(A) Wirkung der Y335A-Mutation auf IC₅₀ Werte für die Hemmwirkung der [ 3 H]DA-Aufnahme durch das (±)-Modafinil und Enantiomere, JHW007 und Kokain im Vergleich zum DAT WT. Der berechnete Unterschied in der Hemmwirkung (IC₅₀) der [3H]DA-Aufnahme durch (±)-Modafinil und Enantiomere in der DAT Y335A-Mutante relativ zu WT wird als IC . dargestellt₅₀Y335A: IC₅₀WT-Verhältnis. Die Daten für JHW007 und Kokain sind zum Vergleich grau dargestellt und stimmen mit zuvor ermittelten Daten überein (36). (B) Wirkung von (±)-Modafinil und Enantiomeren auf MTSET (0.5 mM) Hemmung der [ 3 H]DA-Aufnahme auf dem DAT E2C I159C (eine Mutante, in der zwei endogene Cysteine, Cys90 und Cys306, in Alanine umgewandelt wurden, wodurch sie gegenüber MTSET unempfindlich wird (36), Daten nicht gezeigt). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM der Wirkung der Vorinkubation mit dem angegebenen Arzneimittel auf die MTSET-Reaktivität dargestellt. 100 % Aktivität wird als Vorinkubation des Arzneimittels allein gefolgt von nur dem Vehikel festgelegt. Alle Experimente werden an COS7-Zellen durchgeführt, die vorübergehend DAT WT exprimieren, oder an Mutanten von mindestens drei Experimenten, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden.

Der zweite Assay basiert auf der Reaktivität eines Cysteins, das in Position 159 in TM3 des DAT in der Nähe der Ligandenbindungsstelle auf der extrazellulären Seite inseriert ist. Frühere Beobachtungen in DAT (35, 36, 47, 48), NET und SERT (49) haben gezeigt, dass die Zugänglichkeit dieser Position vom Konformationszustand des Transporters abhängt: Sie ist für die extrazelluläre Umgebung zugänglich, wenn die DAT in . ist die nach außen gerichtete Konformation und unzugänglich in der geschlossenen oder nach innen gerichteten Konformation. Wichtig ist, dass die Reaktion eines eingefügten Cysteins in dieser Position (I159C) mit MTSET zur Inaktivierung der DAT führt, was die Verwendung der DA-Aufnahme als funktionelles Auslesen für die I159C-Reaktivität ermöglicht (36). Die I159C-Mutante wurde in einem MTSET-insensitiven DAT-Hintergrund (E2C) erzeugt, in dem die beiden externen endogenen Cysteine ​​zu Alaninen (C90A-C306A) mutiert waren. Inkubation von 0.5 mM MTSET für 10 min in Puffer führten zu einer Inaktivierung auf etwa 60 % der anfänglichen [ 3 H]DA-Transportkapazität. Die Zugabe von Kokain (30 µM) zusammen mit MTSET führte zu einer deutlichen Erhöhung der Inaktivierung auf nur noch etwa 20 % verbleibende Transportkapazität, während DA (100 µM) und in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen (36) JHW 007 (5 µM) verursachte einen Schutz vor der MTSET-Reaktivität (Abb. 4B). Die Zugabe der R- oder S-Modafinil-Enantiomere (100 μM) bewirkte einen ähnlichen Schutz von Cys159 vor MTSET-Reaktivität wie für JHW 007 beobachtet (98 ± 9 % bzw. 83 ± 9 % für R- und S-Modafinil im Vergleich bis 102±5 % für JHW 007, N=4–8, Abb. 4B). Dies legt weiter nahe, dass beide Modafinil-Enantiomere eine Konformation der DAT induzieren, in der das extrazelluläre Vestibulum geschlossen ist, wodurch Cys159 vor einer Reaktion mit dem hinzugefügten MTSET . geschützt wird.

Mikrodialysestudien mit Kokain, (±)-, R- und S-Modafinil

Um die vergleichende Pharmakologie von Modafinil und Kokain zu untersuchen, haben wir extrazelluläre DA-Konzentrationen in der Maus-NAC-Schale gemessen (siehe Abb. 5 für statistische Analysen). R-Modafinil, (30, 100, 300 mg/kg i.p.), stimulierte die DA-Spiegel signifikant auf etwa 300 % der DA-Basalspiegel 40–60 Minuten nach der Injektion. Diese Werte wurden während der 6-stündigen Messung aufrechterhalten ( Abb. 5A). Ähnliche Effekte wurden mit S-Modafinil erzielt ( Abb. 5B). Wie in früheren Berichten (43, 50) stimulierte Kokain (10 Mmodafinil100 – 55 mg/kg) signifikant die extrazellulären DA-Spiegel, mit raschem Wirkungseintritt und Wirkungsversatz. DA erreichte ein Maximum von etwa 700 % der Basalwerte bei

30 Minuten nach der Kokain-Injektion (Abb. 5C). Der maximale Anstieg des DA-Spiegels stand in engem Zusammenhang mit der Kokaindosis, während die Steigungen der Dosis-Wirkungs-Kurven für Modafinil und seine Enantiomere viel flacher waren (Abb. 5D ), was auf eine begrenzte Dosisabhängigkeit der Wirkung von Modafinil und eine geringere maximale Stimulation von DA im Vergleich zu Kokain hinweist (43).

Auswirkungen verschiedener Dosen von Kokain und Modafinil-Enantiomeren bei Mäusen, die darauf trainiert wurden, Injektionen von Kokain (10 mg/kg) von Kochsalzlösung zu unterscheiden. Kokain wurde 5 Minuten vor dem Test verabreicht und die Modafinil-Enantiomere wurden 60 Minuten vor dem Test verabreicht. Ordinaten für das obere Feld geben den Prozentsatz der Antworten auf dem Kokain-geeigneten Schlüssel an, und die Ordinaten für das untere Feld geben die Häufigkeiten an, mit denen Antworten abgegeben wurden (als Prozentsatz der Ansprechraten nach der Verabreichung von Kochsalzlösung). Abszissen: Arzneimitteldosis in mg/kg (log-Skala). Jeder Punkt stellt die durchschnittliche Wirkung von sechs Mäusen dar, mit Ausnahme der höchsten Dosis von R-Modafinil, die nur bei fünf Probanden untersucht wurde. Beachten Sie, dass die Dosis-Wirkungs-Kurve für R-Modafinil nach links „geschubst“ wurde, um sicherzustellen, dass sie in der grafischen Darstellung der Daten erkennbar ist.

Tabelle 2

Vergleiche von ED₅₀ Werte und Potenzen der Enantiomere von Modafinil im Vergleich zu Kokain bei der Substitution von Kokain bei Mäusen, die darauf trainiert wurden, Kokain von Kochsalzinjektionen zu unterscheiden. Werte in Klammern sind 95 % Konfidenzgrenzen.

Verbindung	ED50 Wert (μmol/kg)	Potenz im Vergleich zu Kokain
Kokain	11.3 * (9.60 – 13.5)	—
(±)-Modafinil	125 * (99.2 – 157)	0.0896 * (0.0677 – 0.120)
S-Modafinil	89.0 (64.0 – 115)	0.127 † (0.0881 – 0.191)
R-Modafinil	132 (77.9 – 226)	0.0883 (0.0513 – 0.159)

Diskussion

(±)-Modafinil und seine R- und S-Enantiomere binden mit relativ geringer Affinität an das hDAT und hemmen die DA-Aufnahme in COS7-Zellen, wobei das R- etwas stärker ist als das S-Enantiomer. Wie bereits in Rattenhirngewebe (17) berichtet, zeigte keines der Enantiomere eine messbare Bindung an SERT oder NET.

Sowohl das R- als auch das S-Enantiomer docken an einer gemeinsamen DAT-Bindungstasche an, die signifikant mit der S1-Bindungsstelle für DA und Kokain (37) sowie für die atypischen DAT-Inhibitoren überlappt, z.G. JHW007 (38). Obwohl eine signifikante Überlappung bei der Bindung der Modafinil-Enantiomere offensichtlich war, wurde ein einzigartiger Rest Tyr156 identifiziert, der unterschiedlich mit den R- und S-Enantiomeren koordiniert ( Abb. 3A und B). Um diese Modelle zu verifizieren, untersuchten wir die Wechselwirkung der Enantiomere mit Tyr156 durch eine einzelne Punktmutation. Dem Modell zufolge wechselwirken beide Enantiomere mit Tyr156, aber nur das R-Enantiomer wechselwirkt mit der Tyr-OH-Gruppe. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Entfernung der OH-Gruppe mit der Mutation von Tyr156 zu einem Phenylalanin R-Modafinil stören würde, aber nur geringe Auswirkungen auf die S-Modafinil-Bindung hat. Tatsächlich zeigte R-Modafinil eine 14-fache Abnahme der Affinität für die DAT-Y156F-Mutante im Vergleich zum DAT-WT-Protein (Abb. 3C; Tabelle 1), während mit S-Modafinil . nur ein geringer Unterschied in den Affinitäten erhalten wurde. Darüber hinaus unterbricht die Entfernung der OH-Gruppe eine Wasserstoffbrücke zu Asp79 in TM1, was vermutlich die Orientierung des Rests verändert und daher die Koordination an das S-Modafinil . nur geringfügig beeinflusst.

Wir haben bereits gezeigt, dass DAT Tyr335 entscheidend für die Regulierung der Konformationsisomerisierung im Transportzyklus ist (34, 35, 45). Tyr335 befindet sich in der dritten intrazellulären Schleife und ist in der Familie der Neurotransmitter:Sodium Symporter (NSS)-Proteine ​​zu 100 % konserviert (51). Die Mutation dieses Rests verändert das Konformationsgleichgewicht des DAT, was dazu führt, dass ein Transporter bevorzugt in einer nach innen gerichteten Konformation liegt (52). Die Kristallstruktur von LeuT, einem bakteriellen Homolog von DAT, unterstützt die Annahme von Tyr335 als Teil eines intrazellulären Tors (46, 53). Unsere Experimente zeigten, dass die R- und S-Modafinil-Enantiomere Y335A:WT IC₅₀ ähnliche Verhältnisse wie bei JHW 007 und im Gegensatz zu Kokain. Dies legt nahe, dass diese DAT-Inhibitoren anders binden als die Kokain-induzierte Konformation und näher an der für JHW 007 beobachteten.

Frühere Beobachtungen von DAT (36), NET und SERT (49) haben gezeigt, dass Cys159 für die extrazelluläre Umgebung zugänglich ist, wenn sich der Transporter in einer nach außen gerichteten Konformation befindet, aber weniger zugänglich wird, wenn sich das extrazelluläre Tor schließt und das DAT in Richtung an . isomerisiert nach innen gerichtete Konformation. Wichtig ist, dass die Reaktion von Cys159 mit dem sulfhydrylreaktiven MTSET zu einer Inaktivierung des Transporters führt, was die Verwendung der DA-Aufnahme als funktioneller Messwert für die I159C-Reaktivität ermöglicht (36). In diesem Experiment schützten sowohl R- als auch S-Modafinil Cys159 vor einer Reaktion mit MTSET, was ihren Bindungsmodus weiter unterstützt, da sie im Gegensatz zu Kokain eine stärker extrazellulär okkludierte Konformation des DAT bevorzugen (Abb. 4B). Diese Ergebnisse stimmen mit der kürzlich berichteten Studie über W84L- und D313N-DAT-Mutanten überein, bei denen (±)-Modafinil WT/Mutanten-Verhältnisse aufwies, die sich von Kokain unterscheiden und eher denen der DAT-Inhibitoren Benztropin, GBR 12909 und Bupropion entsprachen (54).

Obwohl diese In-vitro-Experimente darauf hindeuteten, dass die Modafinil-Enantiomere eher atypischen DAT-Hemmern ähneln, deuten mehrere Berichte über (±)-Modafinil in Modellen des Missbrauchs von Psychostimulanzien auf ein kokainähnliches pharmakologisches Profil hin (4–6). In Übereinstimmung mit der Literatur stimulierten Kokain, Modafinil und seine Enantiomere den DA-Spiegel in der NAc-Schale, was darauf hindeutet, dass diese Medikamente verstärkende Wirkungen haben könnten, wie sie von anderen missbrauchten Drogen hervorgerufen werden (39–41). Die Verabreichung von Kokain zeigte jedoch eine zeit- und dosisabhängige Stimulation der DA-Spiegel, die sich von der durch Modafinil und seine Enantiomere produzierten unterschied. Da eine zeitliche Abhängigkeit zwischen Arzneimittelinjektion und Arzneimittelwirkung ein wichtiges Merkmal der verstärkenden Wirkung von Arzneimitteln ist, sagt dies voraus, dass Modafinil und seine Enantiomere eine geringere Anfälligkeit für Missbrauch beim Menschen haben. Darüber hinaus erreichten die höchsten Dosen von Modafinil und seinen Enantiomeren ähnlich geringere maximale Wirkungen auf den DA-Spiegel als die mit Kokain, was darauf hindeutet, dass sie zwar die DA-Wiederaufnahme blockieren, dies jedoch anders als Kokain. Im Gegensatz zu Kokain wurden die von Modafinil und seinen Enantiomeren erzeugten DA-Erhöhungen bei Dosen erreicht, die 10–15 Mal höher waren als die effektiven Kokaindosen. Zusammengenommen deuten diese Daten auf eine geringe Missbrauchsgefahr für (±)-Modafinil und seine Enantiomere beim Menschen hin.

Obwohl (±)-Modafinil bei mehreren Spezies, einschließlich des Menschen, untersucht wurde, wurden die kokainähnlichen diskriminativen Reizwirkungen der Enantiomere zuvor nicht beschrieben. Wir fanden heraus, dass sowohl die R- als auch die S-Enantiomere von Modafinil bei Mäusen nach einer Vorbehandlungszeit von 60 Minuten vollständig das Kokain ersetzten. und waren

8- bis 11-mal weniger stark als Kokain. Außerdem wurde, wie bei den Mikrodialysaten, keine Enantioselektivität beobachtet.

Es kann mehrere Erklärungen für die Unterschiede geben, die wir in den Computer-/In-vitro-Studien und das Verhalten bei Mäusen im Vergleich zu den benztropinähnlichen DAT-Inhibitoren beobachten. Erstens binden die Modafinil-Enantiomere mit relativ geringer Affinität an das DAT, und ihre Bindungsaffinitäten bei NET und SERT waren zu niedrig, um quantifiziert zu werden, obwohl bereits über eine NET-Bindung berichtet wurde (15). Obwohl die Modafinil-Enantiomere die Diphenyleinheit der Benztropine teilen, deuten frühere Struktur-Wirkungs-Beziehungen darauf hin, dass die Modafinil-Analoga etwas anders an der DAT binden können (55). Darüber hinaus zeigen die hier beschriebenen Modellierungsstudien eindeutig, dass R-Modafinil mit Tyr156-OH interagiert, und diese Wechselwirkung führt wahrscheinlich dazu, dass dieses Molekül eine stärker verschlossene Konformation des DAT bevorzugt, im Gegensatz zu Kokain, wobei die 2-Carbomethoxygruppe a . verhindert H-Brückenbildung zwischen Asp79 und Tyr 156 und hält somit dieses „Tor“ offen (37). Schließlich sind die Modafinil-Enantiomere Nicht-Amin-DAT-Inhibitoren (56, 57), da sie, wie die meisten DAT-Inhibitoren, keinen basischen Stickstoff haben, um mit Asp79 zu interagieren. Daher sind Modafinil und seine Enantiomere möglicherweise nicht „atypisch“, definiert als eine hohe Affinität für die DAT mit einer Präferenz für eine stärker verschlossene Konformation und ohne signifikantes kokainähnliches Verhalten. Sie unterscheiden sich jedoch sicherlich sowohl im Bindungsmodus als auch in der pharmakologischen Wirkung von Kokain und zeigen eine starke Präferenz für eine DAT-Konformation, die sich von Kokain unterscheidet und den Benztropinen ähnlicher ist.

Die vorliegenden Daten sind vergleichbar mit den berichteten diskriminierenden Reizwirkungen von (±)-Modafinil bei Ratten (22) und Primaten (23). Gold und Balster (19) fanden bei Selbstverabreichungsverfahren eine verstärkende Wirkung von Modafinil bei Rhesusaffen, die darauf trainiert waren, Kokain selbst zu verabreichen. Im Gegensatz dazu haben Deroche-Gamonet et al. (58) konnte keine verstärkenden Wirkungen von (±)-Modafinil bei Ratten ohne vorherige Kokain-Selbstverabreichung feststellen. Interessanterweise fand eine Studie heraus, dass die chronische Verabreichung von (±)-Modafinil die Selbstverabreichung von Kokain verringert (23), was seine Verwendung als potenzielle Ersatztherapie bei menschlichen Kokainmissbrauchern unterstützt.